MdWRKY126通过调节苹果酸脱氢酶（MdMDH5）调节苹果果实中苹果酸的积累

【Plant Physiol】MdWRKY126通过调节苹果酸脱氢酶（MdMDH5）调节苹果果实中苹果酸的积累

文章信息

题目：MdWRKY126 modulates malate accumulation in apple fruit by regulating cytosolic malate dehydrogenase (MdMDH5)

刊名：Plant Physiology

作者：Fengwang Ma, Mingjun Li et al.

单位：College of Horticulture Northwest A&F University

日期：25 January

1 文章摘要

有机酸的含量极大地影响肉质水果的口感和贮藏寿命。我们目前对苹果果实中有机酸积累的分子机制的理解集中于铝激活的苹果酸转运蛋白9/Ma1基因。在本研究中，我们使用Ma1的纯合隐性突变体，鉴定了一个独立于Ma1控制水果酸度的候选基因MdWRKY126。对转基因苹果愈伤组织和果肉和番茄果实的分析表明，MdWRKY126与苹果酸含量基本相关。MdWRKY126直接与细胞质NAD依赖性苹果酸脱氢酶MdMDH5的启动子结合，并促进其表达，从而提高苹果果实的苹果酸含量。在MdWRKY126过表达的愈伤组织中，苹果酸相关转运蛋白和质子泵基因的mRNA水平也显著增加，这有助于将积累在细胞质中的苹果酸转运至液泡。这些发现表明，MdWRKY126调节细胞质中的苹果酸合成代谢，并协调细胞质和液泡之间的运输，以调节苹果酸的积累。我们的研究为提高我们对调节苹果果实酸度的复杂机制的理解提供了有用的信息。

在我们之前的研究中，发现“Belle de Boskoop”（BSKP）和“Aifeng”（AF）这两个栽培苹果品种在 Ma 位点（ma1/ma1）是纯合隐性的，但“BSKP”果实表现出高酸度和苹果酸含量，而“AF”的酸度和苹果酸含量很低。经过转录组差异表达分析，鉴定出一个与酸度相关的候选基因 MdWRKY126。MdWRKY126 是 WRKY 转录因子 PhPH3 的同系物，在“BSKP”果实中的表达显着高于“AF”果实。在这里，我们报道 MdWRKY126 直接与苹果酸代谢基因 MdMDH5 的启动子结合，激活其表达并增加苹果果实酸度。我们的研究结果提高了我们对苹果有机酸积累分子机制的理解。

2 文章主要结果

2.1 候选基因MdWRKY126的鉴定、同源性分析、表达及其蛋白的亚细胞定位

在我们之前的研究中，通过对酸性（“BSKP”）和非酸性（“AF”）两个品种苹果果实的数字表达谱分析，发现了77个与苹果果实酸度相关的候选基因；在开花后 30 天和 90 天分析 (DAFB)发现两个品种在 Ma 位点均为 ma1/ma1 基因型。

候选基因MdWRKY126在两个品种之间差异表达。MdWRKY126属于WRKY转录因子家族中的I组，含有2个WRKY结构域和一个锌指基序（图1B）。MdWRKY126位于苹果基因组的11号染色体上，其开放阅读框（ORF）包含1719个碱基，编码572个氨基酸。GFP标记的MdWRKY126蛋白定位于细胞核（图1C）。MdWRKY126及其来自其他物种的同源蛋白的系统发育分析表明，MdWRKY126与PhPH3同源（图1A），据报道，它可以调节矮牵牛花瓣细胞的酸度。

RNA-seq分析表明，在测试的两个阶段，MdWRKY126在“酸性”苹果果实中的表达比在“非酸性”水果中高约8倍。对“BSKP”、“AF”和“Yanhongmei”（YHM，在Ma基因座上为基因型Ma1/Ma1，在成熟果实中显示出低酸度）果实中MdWRKY126的逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析显示出类似的结果，在测试的三个发育阶段（开花后30天、60天、90天），“BSKP”果实中MdWRKY126的mRNA表达水平较高，“AF”果实中表达水平较低（图1D和E）。在“YHM”果实中，MdWRKY126的表达水平随着成熟而降低（图1F）。“BSKP”、“AF”和“YHM”果实中的苹果酸含量与发育过程中的MdWRKY126表达水平相对应（图1，D–F）。这些结果表明，MdWRKY126可能在水果发育过程中调节苹果酸含量中起关键作用。

Fig. 1

2.2 MdWRKY126的过度表达增加了苹果酸的积累

为了研究MdWRKY126在调节苹果中有机酸含量中的作用，将其CDS克隆到pCAMBIA2300载体中，以生成MdWRKY126过表达的苹果愈伤组织（图2A）和番茄（图2G）。

此外，构建了一个干扰载体pK7GWIWG2（I）-MdWRKY126，并将其转化为苹果愈伤组织，以获得MDWRKY1126沉默的愈伤组织系（图2A）。在MdWRKY126转基因系中测定苹果酸盐和柠檬酸盐的含量。在MdWRKY126过表达的苹果愈伤组织和番茄果实中，苹果酸的含量显著增加（图2C和I）。

另一方面，在MdWRKY126沉默的愈伤组织中，苹果酸盐含量显著低于对照，而柠檬酸盐含量几乎没有变化（图2C）。

为了进一步研究MdWRKY126对有机酸含量的影响，分别将pTRV2-MdWRKY 126病毒诱导的基因沉默载体和pCAMBIA 2300-MdWRky 126过表达载体瞬时转化为“富士”苹果果实（图2D）。MdWRKY126的过度表达增加了“富士”苹果果肉中的苹果酸含量，而MdWRKY126的沉默降低了苹果酸含量（图2F），与转基因苹果愈伤组织中的结果类似。仅检测到低水平的柠檬酸盐，与对照相比，MdWRKY126过表达和沉默的苹果样品之间的柠檬酸含量没有显著（ns）差异（图2F）。这些结果支持了我们的假设，即MdWRKY126正调节苹果中苹果酸的积累。

Fig. 2

2.3 MdWRKY126过表达愈伤组织中苹果酸代谢和转运相关基因的表达水平

Ma的合成代谢和苹果酸向液泡的运输对于植物细胞中苹果酸的积累至关重要。为了探索MdWRKY126的下游功能基因，分析了与苹果酸合成和转运相关的基因的表达水平，包括MDH、转运蛋白和质子泵（如补充图S2所示）。与对照相比，五个转运蛋白、三个质子泵和三个MDH基因在三个MdWRKY126转基因系中的mRNA表达水平增加（图3A–C）。

为了进一步研究，检测了11个上调的苹果酸相关基因的mRNA表达水平与苹果果实中苹果酸含量之间的关系，在“AF”、“BSKP”和“富士”苹果果实中进行了RT-qPCR。六个基因在“BSKP”水果中高表达，在“AF”水果中低表达，包括MdMDH5、MdMDH1、MdMDH18、液泡膜二羧酸转运蛋白1（MdtDT1）、液泡质子ATP酶A3-1（MdVHA-A3-1）和液泡H+焦磷酸酶3（MdAVP3），与MdWRKY126表达相似。然而，其他（MdVHA-C2-2、二羧酸转运蛋白1-2[MdDIT1-2]、MdDIT1-3、MdALMT9-3和MdALMT6-1）在苹果果实中未表达或表达非常低（图3D和补充图S3）。这些结果表明，MdMDH5、MdMDH1、MdMDH18、MdtDT1、MdVHA-A3-1和MdAVP3可能是苹果果实中MdWRYK126调控的候选基因

Fig. 3

2.4 MdWRKY126结合MdMDH5的启动子并激活其转录

使用PlantCare分析苹果酸相关基因MdMDH5、MdMDH1、MdMDH18、MdtDT1、MdVHA-A3-1和MdAVP3的启动子区（翻译起始位点上游2000bp）用于顺式作用元件分析。仅在MdMDH5、MdAVP3和MdMDH1的启动子区域中观察到W-box元件（补充图S4A），而已知WRKY转录因子通过与下游靶基因启动子中的W-box元件结合而发挥作用（TTGACC/T）。

然后，挑选MdMDH5、MdAVP3和MdMDH1，以验证MdWRKY126蛋白是否通过体内和体外系统与它们的启动子结合。首先，从35Spro:：MdWRKY126 GFP转基因苹果愈伤组织中提取交联染色质样品，用于染色质免疫沉淀PCR（ChIP PCR）检测。结果表明，与对照相比，在MdMDH5启动子中观察到约6.8倍的富集，而在MdAVP3和MdMDH1基因启动子中检测到ns富集（图4B）。

然后，进行荧光素酶（LUC）激活测定以测试MdWRKY126对MdMDH5、MdMDH1和MdAVP3启动子转录活性的调节。结果表明，与烟草（Nicotiana benthamiana）叶片（图4，E和F）和苹果愈伤组织（补充图S5，B和C）中的其他组合相比，MdMDH5pro:：LUC和35Spro:：MdWRKY126的共表达产生了显著增加的发光信号，但MdWRKY126表达对由MdMDH1或MdAVP3启动子驱动的LUC表达没有影响（补充图S4）。这些结果表明，MdWRKY126在体内结合到MdMDH5的启动子区，但不结合MdMDH1和MdAVP3启动子。

在体外，进行酵母单杂交（Y1H）试验，以研究MdWRKY126和MdMDH5启动子的结合。具有MdMDH5pro pAbAi和MdWRKY126 AD的转化子在SD/Leu+300 ng/mL ABA板上生长良好，而含有MdMDH5-pro pAbAi和pGADT7载体的对照没有生长（图4C），这表明MdWRKY126可以与MdMDH55启动子结合。

此外，还进行了β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告测定，以测试MdWRKY126激活了MdMDH5的表达。含有MdMDH5pro:：GUS和35Spro:：MdWRKY126的苹果愈伤组织细胞中的GUS染色水平和GUS含量显著高于含有MdMDH5pro:∶GUS和35 Spro的细胞（图4，H和I）。因此，MdWRKY126的过表达确实通过与MdMDH5的启动子结合而触发了MdMDH5的表达增加。

Fig. 4

2.5 MdWRKY126主要通过上调MdMDH5的表达水平来增加苹果酸含量

为了描述MdMDH5在苹果酸积累中的生物学作用，将MdMDH5:：GFP瞬时转化到拟南芥叶片原生质体中，以观察亚细胞定位。结果表明，MdMDH5在体内靶向细胞质（图5A）。

之后，过表达MdMDH5和空载体pCAMBIA2300（对照）的愈伤组织（图5B）。RT qPCR评估显示，过度表达MdMDH5愈伤组织中MdMDH的mRNA表达水平比对照组高约4至5倍（图5C）。在MdMDH5过表达的苹果愈伤组织中，苹果酸的积累显著增加（图5D）。

为了进一步验证MdMDH5在促进苹果酸合成中的作用，在过表达的愈伤组织和苹果果肉中检测了MDH的氧化还原活性。与对照相比，过表达MdMDH5或MdWRKY126的愈伤组织和果实中MDH的还原活性显著增强，而其氧化活性的差异不明显（图5，E–H）。这些结果表明，MdMDH5或MdWRKY126的过表达可以增加MDH的还原活性，从而加速OAA向苹果酸的转化。

Fig. 5

为了阐明MdWRKY126通过调节MdMDH5的表达来增加苹果酸含量，将三个重组质粒pCAMBIA2000-MdMDH55、pTRV2-MdMDH5和pCAMBIA2300-MdWRKY126+pTRV2-MdMDH5，空载体pCAMBIA3200和pTRV2作为对照分别注射到苹果愈伤组织中（图6A）。MdMDH5的过度表达触发了苹果酸的积累，而MdMDH-5的表达抑制导致苹果酸含量的降低。当MdMDH5在MdWRKY126过表达的愈伤组织中沉默时，苹果酸含量显著低于单独过表达MdWRKY126的愈伤组织（图6C）。

在“富士”苹果果实上进行了类似的实验。将MdMDH5过表达和干扰构建体以及含有pCAMBIA2000-MdWRKY126和pTRV2-MdMDH5的组合分别注射到苹果中。苹果在注射转化后4天取样（图6D）。注射pCAMBIA2000-MdMDH5后，与对照组相比，MdMDH5的表达增加了约四倍，而注射pTRV2-MdMDH5使MdMDH5的表达减少了约一半（图6E）。MdMDH5的瞬时过表达也增加了苹果酸含量，而瞬时干扰显著减少了“富士”苹果果实中苹果酸的积累（图6F）。与过表达MdWRKY126的苹果相比，用pCAMBIA2000-MdWRKY126和pTRV2-MdMDH5共转化的苹果中苹果酸盐含量显著降低（图6F）。

这些结果表明，MdWRKY126在苹果酸积累中的作用高度依赖于苹果愈伤组织和果实中的MdMDH5。在“BSKP”和“AF”苹果果实中的定量检测表明，MdMDH5在“BSKP”果实中的表达水平约为“AF”果实中表达水平的三倍（补充图S6），与MdWRKY126相似，这为MdWRKY126与MdMDH5启动子结合调节苹果果实中酸含量提供了额外的有力证据。这一结果也解释了为什么“BSKP”是高酸品种而“AF”是低酸品种。

Fig. 6

结论

我们构建了一个模型来阐明苹果中苹果酸盐积累的分子机制（图7）。MdWRKY126通过结合其启动子增强MdMDH5转录能力。MDH的酶活性增强会增加OAA向苹果酸的转化，导致细胞质中苹果酸的大量积累。此外，MdWRKY126的过表达增加了位于液泡膜上的苹果酸转运蛋白和质子泵的mRNA表达，这有利于将积累的苹果酸转移到液泡中，并使苹果酸在细胞质中重新积累。