CONSTANS-LIKE 1a 正向调节大豆的耐盐耐旱性

文章信息

题目：CONSTANS-LIKE 1a positively regulates salt and drought tolerance in soybean

刊名：Plant Physiology

作者：Ning Xia, Lin Zhao  et al

单位：Northeast Agricultural University

日期：12 December 2022

1 文章摘要 

盐胁迫和干旱胁迫是限制大豆（Glycine max [L.] Merr.）生长发育的主要因素；因此，提高大豆抗逆性至关重要。在这项研究中，盐胁迫和干旱胁迫都会诱导CONSTANS 样 1a ( GmCOL1a ) 的 mRNA 水平并稳定 GmCOL1a 蛋白。

与野生型植物相比，转基因35S:GmCOL1a大豆植物表现出增强的耐盐和耐旱性，叶片相对含水量更高，脯氨酸含量更高，丙二醛（MDA）含量更低，活性氧（ROS）产生更少；GmCOL1a敲除co - 9突变体表现出相反的表型。此外，GmCOL1a促进耐盐相关基因的表达，有效降低大豆植株的Na + / K +比值，尤其是35S:GmCOL1a大豆的茎叶。染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq) 分析确定了 GmCOL1a 的两个潜在直接靶标，晚期胚胎发生丰富 ( GmLEA ) 和 Δ 1 -吡咯啉-5-羧酸合成酶 ( GmP5CS ) 基因，这些基因通过染色质免疫沉淀定量聚合酶链反应 (ChIP -qPCR)、电泳迁移率变动分析 (EMSA) 和瞬时转录激活分析发现：

GmCOL1a 直接与 GmLEA 的 Myc(bHLH) 结合和 Che 结合基序结合和GmP5CS启动子刺激 mRNA 表达。对野生型、co-9和35S:GmCOL1a背景下的转基因毛状根GmP5CS:GmP5CS大豆植株的分析进一步表明，GmCOL1a 通过促进转基因大豆毛状根中 GmP5CS 蛋白的积累来增强耐盐和耐旱性。因此，我们证明 GmCOL1a 在大豆的非生物胁迫耐受性中起着重要作用。

2主要结果

2.1 GmCOL1a蛋白的亚细胞定位和空间表达模式

GmCOL1a属于锌指TFs的BBX家族，包含一个或两个B盒模式，有时还包含一个CCT结构域，在植物生长和发育中发挥重要作用，包括开花的光周期调节以及对生物和非生物胁迫的响应。

为了研究大豆GmCOL1a基因之间的系统发育关系，比较了来自大豆（Glycine max）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、番茄（Solanum lycopersicum）、黄瓜（Cucumis sativus）和水稻（Oryza sativa）的105个CO蛋白序列，大多数基因含有B盒模式和CCT结构域，少数基因只含有CCT结构（图1A）。

为了确定GmCOL1a的亚细胞定位，通过在35S启动子的控制下表达编码绿色荧光蛋白（GFP）-GmCOL1a融合蛋白的基因来分析其定位。荧光显微镜观察显示GFP荧光分散在整个细胞中，用对照质粒35S:GFP轰击。相反，35S:GFP-GmCOL1a融合蛋白仅定位于本氏烟草细胞的细胞核（图1B）。为了研究大豆DN50中的组织表达模式，还通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测了大豆根、茎、叶、花、荚和种子组织中GmCOL1a基因的转录丰度。在所有组织中都检测到GmCOL1a的表达，在叶片中表达最高（图1C）。

图1。GmCOL1a的亚细胞定位和空间表达模式。（A） 使用CONSTANS的邻居连接方法（引导值为1000）构建系统发育树。DIR命名法如下：Glycine max（Glyma）、Arabidopsis thaliana（At）、Zea mays（Zm）、Solyc、Cucumis sativus（Cucsa）和Oryza sativa（Os）（B） GmCOL1a蛋白的亚细胞定位。渗透后，将烟草叶片生长2天，并通过荧光显微镜检测GFP信号。使用红色核标记质粒（H2B-RFP）来确认细胞核的位置。GFP：绿色荧光蛋白；RFP：红色荧光蛋白；BF：亮场；合并：GFP、RFP和亮场图像。比例尺=100μm。（C） LDs下GmCOL1a的组织特异性表达。从20天龄的植物中采集根、茎和叶。从52天龄的植物中采集花朵。从68天龄的植物中收集种子和豆荚。所有数据均以大豆GmActin4基因作为内部参考标准化。（D） 35S:GmCOL1a转基因大豆的免疫印迹分析。GmCOL1a FLAG蛋白在LDs下生长20天的转基因幼苗中表达。肌动蛋白用作对照。（E） 通过RT-qPCR测定盐（150mM）和PEG 6000（10%）处理下WT叶片中GmCOL1a的表达。星号表示与对照相比，150 mM NaCl或10%PEG的值显著不同。（F） 在LDs中生长14天并用150mM NaCl或10%PEG 6000处理0、1、3和6小时的GmCOL1a-ox-2幼苗中GmCOL1a蛋白的表达。采集了叶片样本（ZT0为上午7:00），显示了蛋白质提取物的蛋白质印迹。（G） 使用抗FLAG抗体检测FLAG标记的蛋白质。肌动蛋白作为加载控制。GmCOL1a蛋白的水平通过将GmCOL1a信号归一化为ACTIN信号来确定，并表示为GmCOL1a/ACTIN。（H） 在ABA（100μM）处理下，14天龄WT植物叶片中GmCOL1a mRNA水平的RT-qPCR分析。星号表示对照组和ABA组之间的值显著不同。

2.2 GmCOL1a促进大豆耐盐性

为了阐明GmCOL1a在大豆中的生物学功能，我们在“DongNong 50”（DN50）背景中产生了一个独立的CRISPR/Cas9介导的功能缺失突变体（命名为co-9）。DNA测序证实，在co-9突变体中，PAM位点上游的七个碱基（ATGGCTC）被删除，这导致氨基酸转换，最终在684bp处停止翻译（图2A）。

为了进行发芽测定，将三个GmCOL1a ox转基因系co-9和WT的种子播种在具有不同浓度NaCl的发芽培养基[1/2 Murashige和Skoog碱性营养盐，含B5维生素（MSB）和2%蔗糖]上。在0mM NaCl培养基上发芽率没有差异；然而，在含有250mM NaCl的培养基中，WT和co-9种子的发芽受到比GmCOL1a牛种子更大程度的抑制（图2B）。

此外，在250mM NaCl处理后，三个GmCOL1a ox转基因系的下胚轴长度显著长于WT和co-9幼苗，尽管盐胁迫也在较小程度上抑制了GmCOL1a ox转基因系生长速度（图2C）。我们进一步研究了盐处理对大豆根系生长的影响；在袋中正常生长条件下生长的幼苗在初生根中没有显著差异。然而，WT和co-9产生了更短的初生根，在100mM NaCl处理下，三个GmCOL1a ox转基因系显示出更长的根和越来越长的侧根（图2D）。对于在用盐处理的土壤中生长的幼苗，co-9和WT植物在用200mM NaCl处理后8天开始基本枯萎。尽管三个GmCOL1a ox转基因系在未用盐处理时比WT幼苗短，但三个GmPOL1a ox转基因株系显示出比co-9和WT植株更高的高度和更健康的生长。

存活率的统计分析进一步表明，三个GmCOL1a ox转基因系的存活率为62–85%，而WT和co-9植物的存活率分别为30%和20%（图2E）。在逆境条件下保持植物的水分平衡是很重要的。为了研究转基因大豆植物调节渗透胁迫的能力，在盐处理期间评估了叶片相对含水量（RWC）。盐处理8天后，WT和co-9植物的RWC分别下降了31%和48%，但三个GmCOL1a ox转基因系的RWC仅下降了14–15%（图2F）。总之，GmCOL1a的过度表达增加了耐盐性，而co-9突变体增加了盐敏感性。

图2:GmCOL1a正调节大豆的耐盐性。（A） GmCOL1a的基因结构，在外显子中设计了CRISPR/Cas9靶位点。黑线、橙色条和蓝色条分别表示内含子、非翻译区（UTR）和外显子。核苷酸序列表示本研究中设计的gRNA靶向的区域，红色的核苷酸表示原间隔物相邻基序（PAMs）。（B） 拍摄6天龄幼苗的图像，并记录发芽率（n≥20）。比例尺=1 cm。（C）拍摄整个幼苗的图像。比例尺=1 cm。在0（对照）或250mM NaCl处理下WT和转基因系的下胚轴长度。每列代表下胚轴长度（n≥20）。（D） 用0（对照）或100mM NaCl处理的4天龄大豆幼苗的主根长度。在压力处理后21天拍摄图像。每列表示主根长度（n≥20）。收集10个塑料袋中生长的幼苗的根生长袋，并进行类似处理。每个袋子包含两个来自三个GmCOL1a ox转基因系、co-9突变体和WT大豆的幼苗。比例尺=5cm。（E）在200mM盐处理8天后，三个GmCOL1a ox转基因系、co-9突变体和WT大豆的表型和存活率。比例尺=5cm。计算生存率（n≥20）。（F） 从三个GmCOL1a ox转基因系、co-9突变体和在不同浓度NaCl下生长8天的WT大豆（n≥10）中测量了相对叶片含水量。星号表示各组转基因系和野生型之间的值显著不同。

2.3 GmCOL1a通过保持Na+/K+比率增强耐盐性

为了评估GmCOL1a的功能特性，我们比较了不同转基因植物根、茎和叶中K+和Na+的积累。在正常生长条件下，GmCOL1a-ox-2转基因大豆在根、茎和叶中显示出比WT和co-9更高的K+含量和更低的Na+含量。然而，在盐胁迫下，与未处理的植物相比，WT、co-9和GmCOL1a-ox-2的根、茎和叶中的Na+含量明显增加，这导致Na+/K+比率显著增加。尽管在盐胁迫条件下，不同转基因植物根中的Na+/K+比率没有显著差异，但在盐胁迫下，GmCOL1a-ox-2转基因大豆茎和叶中的Na+/K+比率显著低于WT和co-9（图3A）。

为了进一步了解GmCOL1a转基因植物是否通过调节盐胁迫下K+和Na+的获取和分布来维持离子稳态，分析了GmSOS1在Na+外排转运蛋白中的表达水平（Zhang等人，2022）和GmSALT3（第3号染色体上的耐盐相关基因）（Guan等人，2014）。在WT植物中，盐处理后0、1、3和6小时，GmSOS1和GmSALT3都被诱导（图3B）。

我们发现，在150mM NaCl处理3h后，不同转基因大豆植株中GmSOS1和GmSALT3的表达比对照更为上调。GmCOL1a-ox-2转基因大豆植株中GmSOS1和GmSALT3的转录水平高于WT中的转录水平。在co-9转基因大豆植株上观察到相反的结果（图3C）。GmCOL1a通过保持Na+/K+比率来提高耐盐性，从而增加GmSOS1和GmSALT3的表达。

图3。不同GmCOL1a植株的盐敏感性。（A） 在0 mM NaCl或150 mM NaCl处理下分别生长8天的WT、co-9和GmCOL1a牛大豆材料中，根、茎和叶的Na+和K+浓度以及Na+/K+比率。星号表示各组转基因系和野生型之间的值显著不同。（B） 对照和盐（150mM NaCl）条件下WT中GmSOS1和GmSALT3的转录。星号表示对照组和150 mM NaCl组之间的值显著不同。（C） 在150mM NaCl处理3小时后，对GmCOL1a ox和co-9植物14天龄叶片中GmSOS1和GmSALT3的mRNA水平进行RT-qPCR分析。星号表示各组转基因系和野生型之间的值显著不同。

2.4 GmCOL1a促进大豆的抗旱性

在干旱处理中，三个过表达转基因系的绿色持续时间长于WT和co-9植物。在重新浇水4天后，大多数WT和co-9植物未能恢复（分别为33%和23%的存活率），而三个过表达转基因株系显示出更高的恢复率（74-85%的生存率）（图4A，B）。

此外，RT-qPCR分析表明，干旱处理1、3和6小时后，叶片中GmCOL1a的转录水平被诱导（图1E）。然后在缺水处理期间测量RWC。WT和co-9植物的RWC分别减少了52%和63%，但在缺水处理的第5天，三个过表达转基因系的RWC仅减少了13-17%。相比之下，WT和co-9大豆的RWC分别下降了77%和82%，而三个过表达转基因系的RWC在干旱处理的第8天仅下降了55-58%（图4C）。

ABA在调节气孔运动中起着重要作用，与干旱胁迫下的水分损失密切相关。我们进一步验证了ABA处理导致三个过表达转基因系的气孔开口减少，co-9显示出比WT更大的气孔开口（图4D）。这些结果表明，GmCOL1a过表达通过ABA介导的气孔运动增加了耐旱性。

图4。不同大豆植株的干旱胁迫表型分析。（A，B）脱水5天、8天和恢复4天后，三个GmCOL1a ox转基因系、co-9突变体和WT大豆（n≥20）的表型和存活率。对照组每3天用半强度霍格兰溶液浇水一次，此时植物的第一片三叶叶完全展开。比例尺=5cm。（C）干旱处理后三个GmCOL1a ox转基因系、co-9突变体和WT大豆幼苗（n=10）的相对叶片含水量。在干旱处理后的0、5和8天测量水分含量。（D） 左图：用明场显微镜观察10μm ABA处理后的表皮气孔图像。比例尺=10μm。右图：ABA处理后顶部第二片三叶的气孔孔径；使用ImageJ（n＝10）测量气孔孔径的宽度/长度。

2.5 盐旱胁迫下的生理指标分析

为了进一步研究GmCOL1a在调节盐胁迫和抗旱性中的作用，我们测量了脯氨酸、MDA和H2O2含量，以及过氧化氢酶（CAT）、SOD和过氧化物酶（POD）活性，以反映植物对恢复力的反应能力。

首先，我们用硝基蓝四氮唑（NBT）和3，3-二氨基联苯胺（DAB）对大豆根尖和叶片进行染色，以检测三个GmCOL1a ox转基因系、co-9和WT植物在正常或处理条件下的H2O2含量。NBT和DAB染色在正常条件下没有观察到实质性差异；然而，在缺水或250mM NaCl处理下，WT和co-9植物的颜色深度显著高于三个GmCOL1a ox转基因系（图5A）。相反，三个GmCOL1a ox转基因系的叶色深度显著低于co-9和WT植物（图5C、D、F、G）。

最后，我们选择了用于H2O2含量测量的最佳表型GmCOL1a-ox-2系，并发现在co-9突变体的根尖和叶片中H2O2含量最高，而在GmCOL1-ox-2大豆中最低（图5B，E，H）。脯氨酸的积累增强了植物的抗逆性（Ashraf和Foolad，2007）。在对照条件下，不同转基因大豆植株的脯氨酸积累率没有显著差异；然而，在盐胁迫或干旱胁迫下，三个GmCOL1a ox转基因系的脯氨酸含量显著较高。MDA含量用于指示脂质过氧化产物，并反映逆境造成的植物损害程度。与co-9和WT植物相比，GmCOL1a ox转基因植物在盐和干旱胁迫后MDA含量显著降低。SOD、POD和CAT的酶活性清除细胞内ROS并减少H2O2的产生，从而增强耐盐性和抗旱性。co-9和WT植物的SOD、POD和CAT活性显著低于三个GmCOL1a ox转基因系（图5I）。

这些结果表明，大豆中GmCOL1a的过表达通过增加脯氨酸含量、降低MDA含量以及增加SOD、POD和CAT的酶活性以减少ROS的产生，增强了耐盐性和抗旱性。

图5。盐和干旱处理下不同大豆植株的H2O2水平和生理参数分析。（A） 在250mM NaCl或10%PEG 6000处理后3小时，用NBT或DAB对三个GmCOL1a牛转基因系co-9和WT植物的6天龄幼苗的毛根进行染色，并使用半强度Hoagland营养液作为对照。比例尺=0.5 cm。（B）在250mM NaCl或10%PEG 6000处理下3小时，测定GmCOL1a-ox-2、co-9和WT植物根中H2O2含量，并且WT植物经受干旱（不灌溉）处理4天。

2.6 GmCOL1a直接与GmLEA和GmP5CS的启动子结合

为了鉴定大豆中GmCOL1a的DNA结合位点和下游靶基因，并进一步阐明GmCOL1a促进耐盐和耐旱的潜在机制，我们使用GmCOL1a-ox-2大豆叶片进行了ChIP-seq。基于测序数据，GmCOL1a靶基因的两个启动子区GmLEA和GmP5CS被认为直接与GmCOL1a结合（图6A）（补充表S2）。然后，鉴定了GmCOL1a结合、Myc（bHLH）结合和Che结合基序（图6B）。

我们进一步进行了ChIP-qPCR测定，以验证在盐和干旱处理下，通过GmCOL1a结合GmCOL1ox-2转基因大豆植物（表达GmCOL1AFLAG融合蛋白）和WT样品作为阴性对照，GmCOL1a和GmP5CS启动子的潜在富集。在盐和干旱胁迫的0和3小时，携带鉴定的GmCOL1a结合位点的GmLEA和GmP5CS的启动子片段在DNA染色质免疫沉淀（ChIPed）中高度富集，表明分别含有Myc（bHLH）结合基序和Che结合基序的GmLEA和GmP5CS启动子被GmCOL1a结合，尽管与未处理的（0小时）相比，盐或干旱处理3小时后富集度降低（图6C，D）。然后，我们检测了盐和干旱胁迫下不同转基因大豆植株中GmLEA和GmP5CS的转录水平。RT qPCR显示，在盐和干旱处理3小时后，GmCOL1a-ox-2中GmLEA和GmP5CS的转录水平显著升高，而在co-9大豆植株中降低（图6E）。

为了确定GmCOL1a是否能直接结合GmLEA启动子Myc（bHLH）基序（CACGTG）和GmP5CS启动子Che基序（GGATTCTC），使用EMSA分析体外结合。HIS-GmCOL1a显著减少了40bp和32bp探针的迁移，表明GmCOL1a直接结合CACGTG和GGATTCTC基序（图6F）。相互竞争的EMSA显示GmCOL1a与两个基序的强和特异性结合。此外，用分别含有GmCOL1a结合位点、CACGTG基序和GGATTCTC基序的GmLEA和GmP5CS启动子构建了报告基因GmLEA:LUC和GmP5CS:LUC，驱动LUC报告基因（图6G）。

当将表达35S:GmCOL1a-pB7WG2效应器的农杆菌与GmLEA:LUC和GmP5CS:LUC报告子一起共渗透到的叶片中时，GmCOL1a蛋白表达提高了LUC活性，表明GmCOL1a可以促进GmLEA和GmP5CS的转录激活活性（图6H）。总之，结果表明，GmCOL1a蛋白通过直接与启动子结合直接促进GmLEA和GmP5CS的表达。

图6。GmCOL1a蛋白与GmLEA和GmP5CS启动子的结合。（A） 显示综合基因组查看器中所示基因位点的ChIP-seq原始读数的峰值图。箭头表示转录的方向，灰色条表示基因的转录。（B） GmCOL1a结合序列的Motif分析。单个模式在序列中的分布，每个序列的参数设置为0或1。使用用150mM NaCl和10%PEG 6000处理的大豆叶片样品进行0或3小时的GmCOL1a结合GmLEA启动子和GmP5CS启动子的ChIP–qPCR分析。0小时样品收集时间与（C）和（D）中的相同。（E） 用150mM NaCl和10%PEG 6000处理大豆幼苗3小时以收集样品。来自WT、GmCOL1a-ox-2和co-9植物的21天龄叶片中GmLEA和GmP5CS的表达。（F） EMSA分析显示GmCOL1a分别与含有CACGTG和GGATTCTC基序的GmLEA和GmP5CS启动子片段特异性结合。未标记的竞争性探针比标记的探针多25、50、100倍。HIS作为阴性对照。（G） GmCOL1a蛋白对GmLEA和GmP5CS启动子活性的影响。在LDs ZT 12h中检测到烟草叶片中共转染效应基因和报告基因的相对荧光素酶活性。上图：示意图中显示了含有推定图案的碎片的物理位置。星号表示的值与所示的行有显著差异。（H）LDs下GmLEA和GmP5CS的荧光素酶活性。①：35S:GmCOL1apB7WG2+GmLEA:LUC②：pB7WG2+GmLEA:LUC③：35S:PmCOL1a-pB7WG2+GmP5CS:LUC④：pB7WG 2+GmP5CS：LUC。在相同的成像条件下，数字提取两个叶片图像进行比较。

2.7 GmP5CS提高转基因大豆毛状根的耐盐性和抗旱性

值得注意的是，GmCOL1a直接与GmLEA和GmP5CS的启动子结合。GmLEA已被证明是调节盐胁迫的主要基因之一。然而，GmP5CS在盐胁迫或干旱胁迫下的功能尚未报道。为了探讨GmP5CS参与大豆耐盐和耐旱的分子机制，通过根癌农杆菌（A.rhizogene）介导的毛状根转化，在WT、co-9和GmCOL1a-ox-2背景下，产生了表达GmP5CS:GmP5CS-GFP的转基因大豆植株，形成了“复合”转基因植株。将由根状芽孢杆菌菌株K599产生的携带pCAMBIA1302-no35S（对照）的质粒用作大豆植株的对照毛状根。在共焦显微镜下使用GFP鉴定和选择转基因毛状根

（图7A），并去除剩余的非GF P毛状根和主根。盐处理后，在WT背景下具有GmP5CS毛状根的“复合”转基因大豆植株显示出比对照植株更健康的叶片和更大的根伸长。GmP5CS还提高了盐胁迫下具有GmP5CS毛状根的“复合”植物的存活率（图7B）。

此外，与对照植物不同，干旱处理后，GmP5CS毛状根保留了生命过程。重新浇水2天后，大多数GmP5CS转基因大豆植株恢复了活力（87%存活率），但大多数对照植株没有恢复活力（31%存活率）（图7C）。然后，我们测量了盐和干旱处理后GmP5CS“复合”转基因大豆植株的RWC。在盐和干旱处理下，转基因GmP5CS“复合”大豆植株的RWC与对照植株相比显著降低（图7D）。GmP5CS增强了GmP5CS:GmP5CS-GFP“复合”转基因大豆对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。我们还测量了盐和干旱胁迫后毛状根中的脯氨酸含量。与大豆对照毛状根相比，GmP5CS转基因大豆毛状根含有更高水平的脯氨酸，并且在盐和干旱条件下，GmP5CS转基因大豆毛状根的脯氨酸含量增加（补充图S1A）。

为了确定GmP5CS:GmP5CS-GFP“复合”转基因植物是否调节与ROS相关的盐和干旱胁迫，我们测量了CAT、SOD和POD活性。GmP5CS:GmP5CS-GFP“复合”转基因植物的CAT、SOD和POD活性显著高于空载体植物（补充图S1、B、C和D）。结果表明，GmP5CS:GmP5CS-GFP“复合”转基因大豆植物通过增加SOD、POD和CAT酶活性以减少ROS产生，增强了耐盐性和抗旱性。在盐和干旱条件下，GmP5CS:GmP5CS-GFP转基因毛状根中GmP5CS的mRNA水平高于空载体（图7E）。

GmP5CS:GmP5CS转化到WT和GmCOL1a-ox-2大豆背景中。用150mM NaCl或10%PEG 6000处理6小时后，观察转基因幼苗中GmP5CS-GFP的蛋白质水平。正如预期的那样，盐和干旱胁迫在WT和GmCOL1a ox-2背景下都诱导了GmP5CS-GFP蛋白在根中的表达，GmCOL1a-ox-2背景中的GmP5CS-GFP蛋白表达高于WT背景中的表达（图7F），这进一步证实了GmCOL1a促进GmP5CS表达。因此，上述证据强烈表明，GmP5CS是GmCOL1a的下游基因，这是通过增加GmP5CS的表达以增加RWC、脯氨酸含量以及SOD、POD和CAT酶活性来促进大豆中应激反应性GmP5CS蛋白和提高耐盐性和抗旱性所必需的。

图7。盐和干旱胁迫对转基因GmP5CS大豆毛状根的影响评估。

空载体表明大豆毛状根携带pCAMBIA1302-no35S载体，并由发根A.菌株K599产生。GmP5CS:GmP5CS表明大豆植株具有表达GmP5CS的转基因毛状根。（A） 分别在WT、co-9和GmCOL1a-ox-2背景中，在携带pCAMBIA1302-no35S（对照）和GmP5CS:GmP5CS-GFP-pCAMBIA1302质粒的发根A.rhizogenis菌株K599感染的毛状根中检测到GFP荧光。比例尺=100μm。（B） 具有GmP5CS的“复合”植物的表型和存活率：在200 mM NaCl处理6天后，在WT背景下的GmP5CS转基因毛状根。比例尺=5cm。生存率被量化（n≥20）。星号表示与空向量相比有显著变化。所示数据为平均值±SD（*，P<0.05和**，P<0.01，学生t检验）。（C） 具有GmP5CS的“复合”植物的表型和存活率：脱水5天和恢复2天后，转基因GmP5CS毛状根在WT背景中。比例尺=5cm。生存率被量化（n≥20）。星号表示与空向量相比有显著变化。所示数据为平均值±SD（*，P<0.05和**，P<0.01，学生t检验）。（D） 在WT背景下，在200mM NaCl处理6天后或脱水5天后，测量具有GmP5CS:GmP5CS转基因毛状根的“复合”植物叶片的相对含水量。计算叶片的相对含水量（n≥10）。星号表示与空向量相比有显著变化。所示数据为平均值±SD（*，P<0.05和**，P<0.01，学生t检验）。（E） WT背景下转基因毛状根中GmP5CS的转录水平。所示数据为三个独立实验的平均值±SD。（F） 免疫印迹显示GmP5CS:GmP5CS-GFP的GmP5CS蛋白水平，使用GFP标记抗体，抗HPT作为负载对照。暴露于150mM NaCl或10%PEG处理6小时的GmP5CS-GFP的蛋白表达谱。通过将GmP5CS-GFP信号归一化为抗HPT信号计算GmP5CS GFP蛋白的根，并表示为GmP5S-GFP/HPT。所示数据为三个独立实验的平均值±SD。

2.8 GmP5CS的过度表达挽救了co-9植物的盐敏感性和干旱敏感性表型

由于GmP5CS已被证明可以提高盐和干旱耐受性，我们进一步研究了通过A.根际基因介导的毛状根转化将GmP5CS:GmP5CS-GFP转化到co-9突变体背景中是否可以挽救co-9植物的盐和干旱敏感表型（图8A，B）。

在盐和干旱胁迫下，具有GmP5CS毛状根的“复合”植物的存活率分别增加了48.33%和50%（图8C）。同样，在盐和干旱处理后，GmP5CS“复合”转基因大豆植株的RWC分别增加了27.66%和38.18%（图8D）。

图8。转基因大豆毛状根中GmP5CS的过度表达挽救了co-9植物的盐和干旱敏感表型。（A） 具有GmP5CS的“复合”植物的表型：150 mM NaCl处理5天后，在co-9背景中的GmP5CS转基因毛状根。比例尺=5 cm。（B）具有GmP5CS的“复合”植物的表型：脱水6天后，在co-9背景中的GmP5CS转基因毛状根。（C）在盐和干旱胁迫下，GmP5CS转基因毛状根在co-9背景下的“复合”植物的存活率。量化生存率（n≥20）。（D） 在盐和干旱胁迫下，在co-9背景下测定了转基因GmP5CS:GmP5CS毛状根的“复合”植物叶片的相对含水量。计算叶片的相对含水量（n≥10）。

3 结论

基于所有的实验证据，我们提出GmCOL1a是一种调节大豆耐盐性和抗旱性的核酸定位蛋白。GmCOL1a依赖于ABA信号通路促进抗旱性。

模型阐明了GmCOL1a通过分别直接结合抗逆相关基因GmLEA和GmP5CS启动子中的Myc（bHLH）和Che基序来调节盐和干旱胁迫反应，从而上调其转录。GmCOL1a通过促进GmP5CS积累增强了耐盐性和抗旱性，这增加了脯氨酸含量并减少了ROS产量，以保护大豆植物免受盐和干旱胁迫的损害。同时，GmCOL1a也可能独立于下游GmP5CS直接抑制ROS的产生（图9）。

  b

图9。所提出的模型描述了GmCOL1a在调节盐和干旱胁迫耐受性中的作用。实线箭头表示转录激活，虚线表示尚未建立的直接关系，以虚线结尾的线表示转录抑制。GmCOL1a是由耐盐和耐旱性诱导的。GmCOL1a由脱落酸（ABA）介导，从而增强抗旱性。GmCOL1a促进了GmLEA的转录水平，可能是通过减少活性氧（ROS）的积累，从而提高了GmCOL1a过表达转基因植物的耐盐性。此外，GmCOL1a不仅提高了GmP5CS的转录水平，还促进了GmP5CS蛋白的积累，从而增加了脯氨酸含量并减少了ROS的产生，从而提高了大豆植株的耐胁迫性。

原文链接：

https://academic.oup.com/plphys/advance-article-abstract/doi/10.1093/plphys/kiac573/6889457?redirectedFrom=fulltext