【Plant Physiol】苹果MdHT1.2基因介导根际葡萄糖摄取，从而调节植物碳水化合物的分配

【Plant Physiol】苹果MdHT1.2基因介导根际葡萄糖摄取，从而调节植物碳水化合物的分配

题目：Uptake of glucose from the rhizosphere, mediated by apple MdHT1.2, regulates carbohydrate allocation

刊名：Plant Physiology

作者：Fengwang Ma, Mingjun Li et al.

单位：Northwest A&F University, Yangling

日期：15 April 2023

01

摘要

植物根部可以从根际吸收糖分，从而减少光合作用产生的碳的消耗。然而，人们对根用于控制土壤中糖分吸收的潜在机制知之甚少。在这里，我们鉴定了一种苹果 ( Malus × domestica Borkh.) 己糖转运蛋白 MdHT1.2，它在根表皮上发挥作用，从根际吸收葡萄糖 (Glc)。

基于 RNA-seq 数据，MdHT1.2在苹果根部的29 个MdHT基因中表达水平最高。生化分析表明，MdHT1.2主要在细根的表皮细胞中表达，其蛋白位于质膜上。

转基因苹果和番茄的根当用 [ 13 C]-标记的 Glc 或 2-NBDG 供养时，过表达MdHT1.2的品系吸收 Glc 的能力增加，而在苹果中沉默MdHT1.2显示相反的结果。

进一步的研究表明，MdHT1.2 介导的根际 Glc 吸收改变了苹果地上部和根部之间的碳同化物分配，从而调节植物生长。此外，番茄嫁接实验证实，增加过表达MdHT1.2的根部的 Glc 吸收能力可以促进碳水化合物分配到果实中。

总的来说，我们的研究表明，MdHT1.2 在根表皮上发挥作用以吸收根际 Glc，从而调节植物生长和果实糖分积累的碳水化合物分配。

02

技术路线

Gala’ apple (Malus × domestica Borkh.) Plant transformation

Subcellular localization assay\RNA-Seq, RT-PCR and RT-qPCR Analysis\Protein detection and western blot analysis

Histochemical localization and in situ hybridization

Sugar feeding assays

Yeast functional complementation experiment

13C pulse labelling assay

Sugar concentration measurements\Determination of plant growth

Measurement of photosynthetic and ratetotal organic carbon (TOC) content

03

主要结果 

3.1 MdHT1.2是苹果根中单糖吸收的候选转运蛋白

为了鉴定参与苹果根中单糖吸收的所有的HTs，我们使用RNA-seq数据测定了根组织中29个预测HT基因的mRNA水平。在这些MdHTs中，我们发现MdHT1.2在根中具有最高的转录水平（图1A）。使用逆转录定量PCR（RT-qPCR）对从苹果根、茎、叶、果实和茎尖提取的RNA进行MdHT1.2的相对表达分析，证实MdHT120在根中高度表达（图1B）。

根系的分类决定了其生理功能。因此，我们检测了MdHT1.2在苹果主根、侧根和细根中的mRNA表达水平。数据显示，MdHT1.2在细根中的表达水平高于其他根（图1C）。此外，与对照相比，Glc处理后MdHT1.2 mRNA的表达上调至5.6倍。我们推测MdHT1.2是从细根根际吸收单糖的候选转运蛋白。

图1。苹果根中己糖转运蛋白的筛选及MdHT1.2的亚细胞定位。（A） 基于RNA-seq数据的苹果根中29个己糖转运蛋白（HT）基因的FPKM值。（B） 通过RT-qPCR测定MdHT1.2在苹果组织（茎、茎尖、叶、果实和根）中的相对表达。将MdHT1.2在茎中的表达水平设置为1.0。（C） 应用RT-qPCR检测苹果主根、侧根和细根中MdHT1.2的相对表达。（D） 本氏烟草叶片中MdHT1.2-GFP蛋白的亚细胞定位。（E） 苹果（Malus domestica Borkh.）根中MdHT1.2-GFP融合蛋白的亚细胞定位。

3.2 MdHT1.2定位于质膜，主要表达于细根表皮

与大多数糖转运蛋白一致，预测的MdHT1.2蛋白跨膜结构域由12个跨膜结构区表征。为了确定MdHT1.2蛋白的亚细胞定位，我们在本氏烟草叶片中瞬时表达了35S:MdHT1.2-GFP融合蛋白。它清楚地表明，MdHT1.2-GFP的绿色荧光信号位于质膜上（图1D）。

考虑到MdHT1.2在根中的高表达，将35S:MdHT1.2-GFP重组质粒转化到根癌农杆菌（K599）中，以快速诱导苹果（Malus×domestica Borkh.）根的再生。同样，观察到MdHT1.2–GFP的清晰绿色荧光信号，与标记质膜的FM4-64的红色荧光重叠（图1E）。质膜上MdHT1.2–GFP融合蛋白的主要荧光表明，MdHT1.2可能在质膜糖转运中发挥作用。为了更好地理解MdHT1.2的生理功能，我们确定了在表达由MdHT1.2-启动子驱动的GUS的转基因拟南芥植物中的组织和细胞表达特异性（pMdHT1.2%–GUS）。在15天大的转基因拟南芥幼苗中（图2A），GUS染色主要在细根和根毛的表皮（ep）细胞中检测到（图2B-F）。

我们进一步进行了原位杂交，以检测苹果细根中MdHT1.2细胞的特异性。值得注意的是，在苹果根尖成熟区的横截面中，在表皮（ep）细胞中检测到MdHT1.2 mRNA的强信号（图2G），这与GUS染色结果一致。在与感测探针杂交的切片上未检测到信号（图2H）。总之，MdHT1.2在根中的细胞特异性定位表明其可能在根际糖吸收中发挥作用。

图2 MdHT1.2的组织和细胞特异性表达模式。（A） 在MdHT1.2pro:GUS拟南芥幼苗和包括细根（B）、根尖（C）和成熟根（D）在内的根组织中检测到GUS染色。（E） GUS染色后的根尖横截面，以及进一步的藏红染色（F）。（G） 用MdHT1.2反义探针原位杂交分析苹果根尖成熟区横截面中MdHT1.2mRNA的细胞特异性定位。显示了亮场图像。（H） 用MdHT1.2感测探针杂交的苹果根的横截面作为阴性对照。

3.3 MdHT1.2对酵母中的Glc具有转运功能

为了描述MdHT1.2编码蛋白的转运特性，我们将MdHT1.2-ORF克隆到载体pDR196中，并将其转化为己糖转运缺陷酵母菌株EYB.VW4000。这种突变酵母在含有己糖的培养基上没有生长或生长缓慢，但在二糖麦芽糖上生长（图3）。

我们还将pDR196-MdHT1.2载体转化到Suc转运蛋白缺陷酵母突变体SUSY7中，以检测MdHT1.2对Suc的转运能力。这种突变酵母生长在单糖上，例如Glc（图3）。MdHT1.2补充了EYB.VW4000或SUSY7的生长缺陷，在含有1mm-100mM Glc的培养基上有较大的菌落，在10mM Glc培养基上生长最快。

此外，在含有Gal、Fru和Suc的培养基上也检测到轻微生长，但用空pDR196载体转化的酵母突变体在上述糖培养基上没有恢复生长能力（图3）。这些结果表明，与其他糖相比，MdHT1.2对糖类表现出广泛的底物特异性，并对Glc表现出更高的转运能力。

图3。异源表达MdHT1.2后，己糖摄取不足的酵母菌株EYB.VW4000和Suc摄取不足的酵母菌菌株SUSY7中的生长互补。表达MdHT1.2的EYB.VW4000酵母转化体分别在补充有1mM、10mM或100mM Glc（葡萄糖）、Fru（果糖）或Gal（半乳糖）的培养基上培养；将表达MdHT1.2的SUSY7酵母转化体在补充有1mM、10mM或100mM Suc（蔗糖）的培养基上培养。空载体（pDR196）和突变酵母作为对照。

3.4 MdHT1.2有助于根际Glc的吸收，其在苹果中的表达增加了糖含量

为了确定MdHT1.2是否具有从根际向根际运输Glc的能力，我们首先构建了由35S启动子驱动的MdHT120过表达和RNAi载体，然后产生转基因苹果植物。经过PCR、RT-qPCR和蛋白质印迹筛选，我们获得了两个过表达（OE1和OE2）和两个沉默（R1和R2）的苹果系，用于随后的实验（图4A）。

D-Glc的荧光衍生物2-NBDG（2-（N-（7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑-4-基）氨基）-2-脱氧葡萄糖）不被植物代谢，可用于检测Glc的摄取和积累。为了监测MdHT1.2在根中运输Glc的能力，我们首先使用2-NBDG来喂养MdHT1.2-OE和WT根（沉默系没有用2-NBDG喂养，因为它们表达GFP荧光蛋白）（图4B）。在与200μM 2-NBDG孵育5小时后，MdHT1.2-OE苹果根表现出比WT更强的荧光强度（图4B，C），表明MdHT1.2的过表达可能导致根中Glc的吸收能力显著增强。

为了证实这一结果，转基因苹果根也与[13C]-标记的Glc一起孵育。MdHT1.2-OE根中的13C含量始终高于WT，但MdHT1.27-RNAi根中的含量低于WT（图4D）。这进一步支持了MdHT1.2在根中Glc吸收中的功能。此外，与野生型相比，MdHT1.2-OE根表现出更高的糖水平，Glc浓度比野生型增加了约30%。相比之下，沉默苹果根中的Glc浓度比野生型低12%（图4E）。令人惊讶的是，伴随着Glc运输的增强，在过表达MdHT1.2的苹果根中，Fru、Suc和Sor（山梨醇）也增加，而在MdHT1.2-RNAi系中，相对于野生型中的水平，Fru，Suc和Sor分别减少了约8%、约20%和约50%。

图4。MdHT1.2有助于苹果根际对Glc的吸收。（A） MdHT1.2过表达（OE1和OE2）和沉默（R1和R2）的苹果系在葡萄糖含量为4.4g.kg-1DW的土壤中生长。（B） 在与200μM 2-NBDG孵育5小时后，2-NBDG在MdHT1.2过表达转基因系（OE1和OE2）的细根和野生型植物中的积累。比例尺，100μM。（C） 2-NBDG在OE和WT苹果根中的相对荧光。（D） 将植物在补充有[13C]-Glc的Hoagland营养液中孵育，并在孵育10小时后测量转基因和野生型苹果根中放射性13Glc的量。（E） 转基因和野生型植物根中的葡萄糖（Glc）、果糖（Fru）、蔗糖（Suc）和山梨醇（Sor）浓度。（F） 转化和野生型苹果叶片的光合速率。

3.5 MdHT1.2介导的根际Glc吸收可改变同化糖的碳分配，调节苹果植株生长

为了进一步了解MdHT1.2介导的根际Glc转运是否影响植物生长，我们首先检测了转基因苹果植物的生长表型（将苹果植物移植到Glc含量为4.4 g.kg-1 DW的土壤中）（图4A）。与WT相比，OE苹果品系的株高、主根长度和根鲜重显著增加，而R1和R2品系的这些指标有所下降（图4A，S5）。

此外，与WT相比，MdHT1.2-OE苹果的总有机碳含量（TOC）在根和地上部都有所增加，但在沉默系中有所减少（图S5D）。尽管在MdHT1.2-OE苹果植株中生物量积累增加，在沉默系中减少，但与野生型相比，转基因苹果系的光合速率没有变化（图4F）。这表明，MdHT1.2介导的Glc吸收以一种不包括改变叶片光合能力的方式影响苹果植物的生长。

为了进一步研究植物生长与MdHT1.2介导的根际Glc吸收之间的关系，将苹果植株（转基因和野生型）在含有或不含有0.5%Glc的霍格兰溶液中水培15天。结果表明，与野生型相比，Glc喂养显著促进了MdHT1.2-OE植物的生长，这是通过增加植物高度和根系生长来实现的，但由于Glc吸收减少，这种增强在MdHT1.2-RNAi植物中没有发生（图5A，B）。与没有Glc的对照相比，Glc对根的喂养增加了MdHT1.2-OE植物的生长速率，但降低了MdHT1.2-RNAi植物的生长速度（图5C，D）。这些结果表明，MdHT1.2介导的Glc在根中的吸收对苹果植株的生长有正向调节作用。

尽管Glc喂养后OE系的生物量显著增加，但与WT相比，干重根冠比显著降低（图5E）。因此，我们推测MdHT1.2介导的Glc吸收可能会影响C从地上部到根部的分配。为了验证这一推测，进行了13C脉冲标记。将苹果叶片与来自Na13CO3的13CO2一起孵育，然后定量同化的13C的量，并计算芽和根中的13C分配率。数据显示，MdHT1.2-OE苹果根中的13C分布率比野生型低约14%，并且在沉默系中发现根中13C的相对富集度最高（图5F）。相应地，与WT相比，OE系在地上部的13C富集度增加了14%。总之，这些数据表明，MdHT1.2介导的根际Glc吸收可以促进植物生长并改变碳水化合物的分布。

图5。MdHT1.2介导的根际Glc吸收可以改变同化糖的碳分配，并调节苹果植物的生长。（A） WT、MdHT1.2过表达（MdHT1.2-OE）和沉默（MdHT1.2-RNAi）苹果植物的生长表型，在含有或不含有0.5%葡萄糖（Glc）的液体培养基中生长15d。比例尺，6cm。（B）测量根生长指标的数量，包括根表面积、根体积、顶端和长度；（C） Glc处理下MdHT1.2-OE、-RNAi和WT苹果植株的株高和（D）相对生长速率（鲜重）。（E） 根：茎干重比。（F） 在Glc条件下对WT、MdHT1.2-OE和MdHT1.2-RNAi苹果植株进行了13C脉冲标记。在根和地上部计算13C分配速率（13C分配率是指每个器官的13C含量与植物对13C的净吸收量的比率）。

3.6 异源表达MdHT1.2增加番茄根际Glc吸收，促进植物生长和糖积累

为了进一步证实MdHT1.2在根际Glc吸收中的作用及其对植物生长的积极影响，产生了三个异源过表达MdHT12的番茄品系（L12、L17和L21）。在转基因番茄系中观察到与苹果相似的结果。2-NBDG供给试验表明，番茄中MdHT1.2的过表达增加了根中Glc的运输（图S7A，B）。

此外，转基因番茄根的糖浓度、总有机碳含量和主根长度增加（图S7C、D、S8A、B），干重根冠比降低（图S8C）。我们还用沙子中的番茄进行了Glc供给试验，以检测MdHT1.2介导的Glc吸收与植物生长之间的关系。在对照条件下，转基因和野生型番茄植株之间的生物量积累没有观察到显著差异。与对照相比，在+Glc条件下，转基因和野生型番茄植株的地上部和根部鲜重增加，但转基因番茄植株比野生型植株有更多的生物量积累，根和地上部鲜重更重，表明MdHT1.2介导的Glc吸收正调节植物生长。然而，在+Glc处理下，转基因番茄植株的根冠比急剧下降，这表明碳水化合物分配可能发生变化（图S9D）。

为了进一步了解MdHT1.2在果实中糖调节中的作用，我们彻底研究了MdHT1.2-过表达番茄果实（L17和L21），因为转基因苹果果实需要很多年的时间。我们在含有4.4 g.kg-1 DW-Glc的土壤中种植转基因和野生型番茄，转基因番茄的成熟果实显示出显著增加的果实重量和可溶性固形物含量（SSC）（图6A-C）。此外，转基因番茄果实在四个阶段[幼期（开花后7天，DAB）、膨大期（17DAB）、破碎期（30DAB）和成熟期（45DAB）]表现出持续高于野生型果实的Glc、Fru、Suc和Gal浓度（图6D），表明MdHT1.2的异源过表达可以积极调节番茄果实中的糖积累。

图6。MdHT1.2在番茄中异源表达增加了根际对Glc的吸收，促进了果实发育过程中的糖积累。（A） WT和MdHT1.2-OE番茄果实。比例尺，1cm。（B）WT和MdHT1.2-OE番茄（L17和L21）果实的果实重量和（C）可溶性固形物含量（SSC，%）。（D） 四个发育阶段的可溶性糖浓度测定：7 DAB（开花后天数）（幼果）、17 DAB（膨胀期）、30 DAB（破碎期）和45 DAB（成熟果）。

3.7 在嫁接实验中，番茄中的MdHT1.2可以促进碳水化合物向果实的分配

由于上述发现表明，根际Glc输入的增加可能会影响碳分配（图5F），我们推测异源表达MdHT1.2的番茄果实糖含量的增加也可能是由同化碳在果实中的分布增加引起的。为了验证这一假设，WT和转基因番茄系L17相互用作接穗和砧木进行嫁接实验。创建了四个嫁接组合（接穗/砧木）：WT/WT、L17/WT、WT/L17、L17/L17，它们在有或没有Glc的沙子上生长（图7）。结果表明，外源Glc处理促进了番茄果实的膨大，施用Glc后，果实重量和可溶性固形物含量（SSC%）均显著增加（图7A-C）。有趣的是，当L17在+Glc条件下用作砧木时，这种对果实生长的促进更为明显。此外，当MdHT1.2在番茄根中表达时，成熟果实中的Fru、Glc和Suc也显著增加（WT/L17和L17/L17），而对照中嫁接番茄之间没有差异（图7D-F）。糖含量的增加并不影响光合作用（图7G）。13C脉冲标记显示，没有Glc的生长不会改变嫁接番茄植物的碳分配，但根来自L17（MdHT1.2-OE）的植物的生长确实增加了C向果实的分配速率（图7H）。这表明MdHT1.2介导的根际Glc吸收可以改变同化C在果实中的分布，并调节果实中的糖积累

图7。在嫁接实验中，通过异源表达MdHT1.2增加番茄根际对Glc的吸收，可以促进碳水化合物向果实的分配。（A） WT/WT、L17/WT、WT/L17、L17/L17（接穗/砧木）的嫁接组合在含有（＋Glc）或不含有（对照）Glc的沙子上生长后，在45DAB中的表型（开花后几天）。（B） 在有或没有Glc处理下，嫁接组合WT/WT、L17/WT、WT/L17、L17/L17的成熟果实中的果实重量和（C）可溶性固形物含量（SSC%）。（D-F）转基因和野生型番茄果实中的葡萄糖（Glc）、果糖（Fru）和蔗糖（Suc）浓度（45DAB）。（G） 嫁接番茄在添加或不添加Glc处理下的光合速率。（H） 在＋Glc和对照条件下对嫁接植物进行13C脉冲标记试验，然后计算标记的13C在根、茎（叶+枝）和果实中的分配率（13C分配率是指每个器官的13C含量与植物对13C的净吸收量的比率）。

04

结论

我们的研究表明，MdHT1.2是一种苹果己糖转运蛋白，在根表皮上发挥作用，从根际吸收Glc，促进根的生长，这减少了从地上部到根部的同化碳分配（源叶碳供应-汇根碳需求），导致同化碳向其他库（如果实）的分配增加。在异源表达MdHT1.2的番茄中，MdHT1.2-介导的Glc在根部的吸收可以改变碳分配，并最终增加果实生物量。

考虑到苹果树生长周期长，番茄嫁接试验进一步验证了这种碳分配。总之，MdHT1.2介导的根Glc吸收可以调节源库碳水化合物的分配，并最终促进植物发育和果实糖的积累（图8）。

这项研究填补了己糖转运蛋白在介导根际糖获取和调节源库同化碳分布方面的作用空白，MdHT1.2-OE植物有望成为潜在的优良砧木，可用于提高碳源化合物的利用效率和果实质量

图8。MdHT1.2在根际Glc吸收和植物生长和果实糖积累的碳水化合物分配调节中的作用模型。MdHT1.2是一种苹果己糖转运蛋白，有助于Glc从根际吸收到根部，这可以促进根系生长，减少从地上部到根部的同化碳分配（源-叶-碳供应-汇-根-碳需求），导致同化碳分配增加到其他储库，如果实。考虑到苹果树的长生长周期，通过使用异源表达MdHT1.2的番茄进行嫁接实验，验证了MdHT1.2-介导的根系葡萄糖吸收与果实质量之间的关系。